Диагностика хламидиоза (хламидий)
Главными трудностями при выявлении хламидии оказываются их малые размеры, а также неспособность расти на искусственных питательных средах. Поскольку хламидии обитают внутри клеток цилиндрического эпителия, исследуют соскоб эпителия, а не выделения из мочеиспускательного канала, как при гонорее.В настоящее время существует ряд диагностических методов, используемых для выявления хламидийной инфекции:
— выделение возбудителя в культуре клеток;
— микроскопический;
— серологический;
— иммуноферментный анализ;
— метод ДНК-зондов;
— метод полимеразной цепной реакции (ПЦР);
— метод лигазной цепной реакции (ЛЦР);
— транскрипционная амипификация (ТА);
— прямая иммунофлуоресценция (ПИФ).
Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Рекомендуется использовать комбинацию нескольких методов обследования. Наиболее информативным в диагностике хламидиоза является культуральный метод выявления хламидий, однако в силу высокой стоимости и трудоемкости он не имеет широкого распространения. Для экспресс-диагностики хламидиоза предпочтительнее использовать метод прямой иммунофлуоресценции с моноклинальными антителами. Для массовых скрининговых обследований предпочтительно использовать иммуноферментный метод. Современные серологические методики, способные обнаруживать не только IgG, но также IgA и IgM, особенно важны для выявления хламидий у детей, при наличии инфекции в труднодоступных для взятия соскобного материала местах, осложненном течении урогенитального хламидиоза и болезни Рейтера. Культуральный метод очень важен при подозрении на наличие персистирующей хламидийной инфекции, поскольку способствует выявлению характерных для такого течения хламидиоза цитоплазматических включений.
Наиболее современными методами диагностики хламидиоза (хламидий) являются методы ДНК-диагностики, но они требуют исключительно высокого качества реагентов и четкости соблюдения всей технологической цепочки от забора материала до интерпретации результатов. Выделение хламидий в культуре клеток является традиционным методом диагностики. Этот метод обладает наивысшей 100%-ной специфичностью и является "золотым стандартом" и юридическим стандартом для С. trachomatis. Однако его использование ограничено в связи с чрезвычайно высокой трудоёмкостью (расход времени от 42 до 72 часов), дороговизной (оснащённая лаборатория, транспортировка живых организмов). Обнаружение цитоплазматических включений хламидий в эпителиальных клетках препаратов, окрашенных по методу Романовского-Гимзы, является классическим методом диагностики хламидиозов. Цитоплазматические включения хламидий представляют собой компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную форму, отличаясь от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца, имеют сине-фиолетовую окраску, крупные включения с преимущественно мелкими зрелыми структурами возбудителя — розово-красную. Однако метод имеет низкую чувствительность и позволяет диагностировать около 15% случаев хламидийной инфекции у больных мужчин и у 40% женщин, да и то при достаточно высокой квалификации лаборанта и при больших временных затратах. Данный метод имеет право на существование лишь при технической невозможности применения других методов.
Для серодиагностики хламидиоза (хламидий) используют следующие методы — общепринятую РСК (реакция связывания комплемента) и серодиагностику с родоспецифическим антигеном (общим для С. trachomatis и С. psittaci), а также микрометод реакции непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) с типоспецифическими антигенами С. trachomatis. Серологические методы просты в исполнении, однако дают большой процент ложноположительных результатов, обусловленных перенесенной в прошлом хламидийной инфекцией. Они имеют ограниченную ценность для диагностики хламидийной инфекции. Для подтверждения хламидийной инфекции необходимо использовать дополнительные методы или проводить повторные серологические исследования для наблюдения за титром реакции. РСК позволяет определить только групповые антигены, малочувствительна и у больных хламидийными уретритами дает не более 15% положительных результатов. Серологические методы непригодны для диагностики при острых генитальных инфекциях, но могут быть полезными при осложненных или хронических инфекциях, а также как методы скрининга больших групп населения с последующим отбором серопозитивных лиц для дальнейшего обследования.
Диагностика хламидиоза с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) основана на улавливании изменения цвета субстрата спектрофотометром. Достоинства ИФА заключаются в простоте транспортировки и хранения полученных материалов, объективности оценки результатов, возможности автоматизации и одновременного исследования множества проб. Его недостатком является невозможность исключения ложноположительной реакции, сложность контроля за качеством исследований, высокая стоимость аппаратуры, меньшая чувствительность и специфичность метода, чем реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с моноклинальными антителами.Тесты, основанные на методике ДНК-зондов, применяемые для диагностики хламидиоза (хламидий), имеют множество преимуществ с точки зрения удобств транспортировки, обработки больших партий и скорости исследования. Один из тестов, основанных на методе ДНК-зондов, состоит из отдельных, меченных акридином ДНК-зондов для С. trachomatis и Neisseria gonorrhoeae, коплементарных нуклеотидной последовательности рибосомной РНК каждого из патогенных микроорганизмов. Это позволяет учитывать результаты гибридизации по хемилюминесценции. Так как рибосомной РНК в клетке в 104 раз меньше чем ДНК, такая методика является более чувствительной, по сравнению с методами, в которых мишенью для зондов выступает ДНК. Новая методика сравнима или превосходит культуральную и некоторые методы ИФА при исследовании цервикального материала. Её чувствительность и специфичность 78— 97% и 98—100% соответственно. Однако этот метод, как и ИФА, имеет относительно низкую по сравнению с культуральным методом чувствительность при вялотекущей хламидийной инфекции.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и его варианты обнаруживают хламидийную инфекцию по нескольким молекулам ДНК. ПЦР является стандартным методом амплификации ДНК во многих молекулярно-биологических лабораториях. Основу методики составляют повторяющиеся циклы направляемого олигонуклеотидами синтеза ДНК, приводящие к репликации in vitro нуклеотидных последовательностей мишени. Основные преимущества метода ПЦР в диагностике хламидиоза (хламидий): высокая чувствительность и специфичность; неинвазивность и простота сбора проб; простые требования к условиям транспортировки и хранения; возможность скрининга больших популяций; скрининг бессимптомной инфекции; постановка реакции в полуавтоматическом режиме и быстрота получения результатов. Метод применяется как при исследовании цервикальных и уретральных мазков, так и осадка мочи. Исследование в качестве исследуемого материала мочи, представляет собой неинвазивный метод диагностики или скрининга уретральной инфекции у мужчин, значительно упрощающий обследование. На сегодняшний день, безусловно, это наиболее чувствительный метод диагностики генитальной хламидийной инфекции (хламидиоза; хламидий).
Лигазная цепная реакция (ЛЦР) — это второй молекулярно-биологический метод выявления хламидиоза (хламидий). В его основе лежит легирование олигонуклеотидов, комплементарных определённой ДНК-мишени. В методе используется способность ДНК-лигазы соединять 2 пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями мишени in vitro. ЛЦР может быть использована для анализа уретральных, эндоцервикальных образцов и проб мочи, представляя собой неинвазивный метод скрининга для выявления C.trachomatis. ЛЦР явилась первой методикой, обладающей повышенной чувствительностью определения C.trachomatis в моче у женщин. Чувствительность и специфичность метода составляет 94,7% и 99,8% соответственно по сравнению с культуральным методом.
Транскрипционная амплификация (ТА) — новый метод молекулярной амплификации С. trachomatis, который основан на применении амплификации посредством транскрипции и гибридизационной защиты для качественного определения рибосомной РНК С. trachomatis в эндоцервикальных образцах, уретральных образцах у мужчин, а также в исследуемых пробах мочи обоих полов. Чувствительность нового метода будет чрезвычайно высокой (>99%), однако для окончательного определения его эффективности требуются дополнительные исследования в различных популяциях.
Иммунофлуоресцентный метод — прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) с использованием моноклональных антител против основного белка наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis — является в настоящее время во всем мире основным методом диагностики. С использованием ПИФ впервые стало возможным быстро и точно выявлять хламидийную инфекцию в исследуемом материале (30—40 минут). ПИФ включает использование меченных флуоресцеином моноклинальных антител как к липополисахариду, так и к основному белку наружной мембраны (МОМР) хламидий. Фиксированный на предметном стекле мазок обрабатывается флуоресцирующими антителами и исследуется под флуоресцентным микроскопом после 20-минутной инкубации. Метод ПИФ высокочувствительный, специфичный, прост в исполнении. Недостатком метода является то, что само обнаружение наружной мембраны хламидий ещё не является доказательством наличия жизнеспособного организма. Это следует учитывать при установлении излеченности от хламидиоза. Кроме того, метод ПИФ недостаточно чувствительный при асимптомной и вялотекущей инфекции. Таким образом, с практической точки зрения наиболее удобным, информативным, быстрым по исполнению методом первичной диагностики хламидийной инфекции можно считать метод ПИФ (прямой иммунофлуоресценции) с моноклональными антителами. Методы молекулярной амплификации (ПЦР, ЛЦР, ТА) являются средством массового скрининга пациентов для обнаружения С. trachomatis. Метод ПЦР — наиболее чувствительный некультуральный метод диагностики хламидийной инфекции.
